Documents and resources

Todo lo que verás describe la replicación en procariotas, específicamente en Escherichia coli. Los eucariotas siguen el mismo principio y la lógica es prácticamente idéntica, pero emplean algunas proteínas distintas y añaden pasos que aquí no aparecen. Cuando no se indique el organismo, asume procariota.

Antes de empezar

Las siete proteínas de la replicación del ADN, una por diapositiva: helicasa · girasa · SSB · primasa · ADN polimerasa III · ADN polimerasa I · ligasa. Desde que se abre la hélice hasta el sellado final de la cadena.

En este documento

Las proteínas de la replicación del ADN , una por una. Todo el proceso en procariotas, E. coli como modelo. Cómo una célula se copia a sí misma

Dogma central

Cada error que sobrevive a los tres filtros se hereda a todas las células hijas. La mayoría son silenciosas, pero las que caen en genes de control del ciclo celular están detrás de buena parte de los procesos tumorales.

Por qué importa

La ADN polimerasa sola se equivoca una vez cada 100,000 nucleótidos. Su actividad exonucleasa 3' →5' revisa lo recién colocado y baja el error a 1 en 10⁷. El sistema de reparación de apareamientos limpia lo que se escapó y llega a 1 en 10⁹. La fidelidad no es mérito de una única enzima.

De dónde viene la precisión

El genoma humano tiene unos 3,200 millones de pares de bases. Escherichia coli , el organismo de las siguientes diapositivas, tiene 4.6 millones — unas 700 veces menos, y aun así tarda 40 minutos en copiarlo todo. La diferencia está en la estrategia: E. coli abre un solo origen de replicación ; la célula humana abre decenas de miles a la vez.

La escala real

Y hacerlo en cuestión de horas cada vez que una célula se divide. Con una tasa de error de 1 en mil millones de nucleótidos. 3,200Copiar todo, sin errores millones de pares de bases en humanos.

El problema

Las mutaciones en helicasas de la familia RecQ —como WRN— no afectan esta apertura rutinaria, sino la resolución de estructuras difíciles. Ese es el origen del síndrome de Werner.

La conexión

Cada ciclo de apertura consume ATP. Sola avanza despacio; acoplada a la ADN polimerasa III alcanza unos 1,000 pares de bases por segundo. Helicasa y polimerasa no van una detrás de otra: van unidas en un mismo complejo, el replisoma, y se aceleran mutuamente.

El costo

La helicasa DnaB de E. coli es un hexámero en forma de anillo que rodea la hebra molde de la cadena rezagada y avanza en dirección 5' →3'. Rompe únicamente los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias; el esqueleto de azúcar-fosfato queda intacto. No confundir con la girasa: la helicasa separa las cadenas, la girasa resuelve la tensión que esa separación genera por delante. Problemas distintos, soluciones distintas.

El mecanismo

La helicasa no se posa en cualquier punto. E. coli tiene un único origen de replicación, llamado oriC, con repeticiones ricas en adenina y timina. Ese par se une con dos enlaces de hidrógeno frente a los tres de guanina-citosina, así que es la zona más fácil de abrir del cromosoma. La proteína iniciadora DnaA reconoce el sitio, separa las primeras bases y ahí carga a la helicasa.

Dónde empieza

La helicasa rompe los enlaces de hidrógeno entre las bases y separa las dos cadenas. Se forma la horquilla de replicación. HelicasaAbriendo la hélice

Paso 1 de 7

Las quinolonas —ciprofloxacino, levofloxacino— son antibióticos que bloquean la girasa bacteriana: atrapan la enzima justo cuando ha cortado el ADN pero aún no lo ha sellado, y el genoma queda fragmentado. Como los humanos no tenemos girasa, el fármaco actúa sobre una diana que solo existe en la bacteria. Es toxicidad selectiva, no inocuidad: a concentraciones altas las quinolonas alcanzan la topoisomerasa II humana, y por eso tienen efectos adversos documentados.

La conexión

Es la única topoisomerasa capaz de introducir superenrollamientos negativos en contra del equilibrio termodinámico, y por eso necesita hidrólisis de ATP. Las topoisomerasas de tipo I, en cambio, solo relajan tensión existente y no consumen energía.

El costo

Al abrirse la hélice, la torsión no desaparece: se acumula por delante en forma de superenrollamientos positivos. La ADN girasa —una topoisomerasa ausente en células humanas— corta transitoriamente ambas cadenas, pasa un segmento de la doble hélice a través del corte y vuelve a sellarlo. El resultado es la introducción de superenrollamientos negativos que compensan la tensión.

El mecanismo

Separar la hélice retuerce el ADN que viene por delante. La girasa corta ambas cadenas, libera la torsión y vuelve a sellarlas. GirasaLiberando la tensión

Paso 2 de 7

Impide dos accidentes a la vez: que las cadenas complementarias vuelvan a emparejarse, y que una misma cadena se pliegue sobre sí misma formando horquillas internas. Cualquiera de los dos bloquearía el paso de la polimerasa.

La conexión

No consume ATP y no cataliza ninguna reacción: es una proteína estructural, no una enzima, y aun así sin ella la horquilla se cerraría casi tan rápido como se abre.

El costo

En E. coli actúa como tetrámero y se une sin especificidad de secuencia: no le importa qué bases haya, solo que la cadena esté sencilla. Su unión es cooperativa — cada tetrámero facilita la llegada del siguiente, así que recubren tramos completos en vez de puntos aislados.

El mecanismo

Una cadena sencilla es frágil: puede volver a cerrarse o ser degradada . Las proteínas de unión a cadena sencilla (SSB) la mantienen abierta y disponible. SSBProtegiendo lo expuesto

Paso 3 de 7

La limitación de las ADN polimerasas es estructural y absoluta: solo pueden extender una cadena existente, nunca iniciarla . Toda la complejidad de la cadena rezagada —fragmentos repetidos, cebadores múltiples, limpieza posterior— existe únicamente por esta restricción.

Por qué importa

No trabaja sola: se asocia físicamente con la helicasa formando un complejo llamado primosoma . Esa asociación sincroniza la colocación de cebadores con el avance de la horquilla, algo crítico en la cadena rezagada, donde hacen falta muchos.

El costo

La primasa (DnaG en E. coli ) es en realidad una ARN polimerasa especializada. A diferencia de las ADN polimerasas, sí puede iniciar una cadena desde cero, y sintetiza un fragmento corto de ARN —unos 11 o 12 nucleótidos— complementario al molde. Ese cebador aporta el extremo 3'-OH libre que la ADN polimerasa III necesita para engancharse. Esa capacidad de iniciar desde cero es la que tienen todas las ARN polimerasas, y es la razón de que la transcripción no necesite cebador.

El mecanismo

Ninguna ADN polimerasa puede empezar de cero: todas necesitan un extremo 3' libre del cual jalar. La primasa fabrica ese punto de partida — un cebador de ARN . PrimasaEl punto de partida

Paso 4 de 7

Ambas cadenas se sintetizan al mismo tiempo y por el mismo complejo enzimático. Para lograrlo, la cadena rezagada forma un bucle que la reorienta temporalmente, de modo que las dos polimerasas puedan avanzar juntas pese a leer en direcciones opuestas.

Por qué importa

Alcanza unos 1,000 nucleótidos por segundo, el mismo ritmo que la helicasa porque van acopladas en el replisoma. Pero por sí sola se soltaría del molde cada pocas decenas de bases. La pinza deslizante β —un anillo proteico que la abraza al ADN— es lo que la mantiene enganchada. Sin esa pinza, su procesividad caería a unas decenas de nucleótidos por evento de unión.

El costo

La ADN polimerasa III solo añade nucleótidos en dirección 5' →3'. Como las cadenas son antiparalelas, esa única dirección significa cosas opuestas en cada una: en la líder coincide con el avance de la horquilla y la síntesis corre sin interrupción; en la rezagada apunta en sentido contrario , así que la enzima debe soltarse y volver a empezar cada vez que se expone molde nuevo. Esos tramos miden entre 1,000 y 2,000 nucleótidos en E. coli .

El mecanismo

Síntesis de ADN continua. Un solo cebador. Avanza en la misma dirección en que se abre la horquilla. Síntesis de ADN discontinua. Un cebador por cada fragmento de Okazaki. Avanza en contra de la apertura. Cadena líder Cadena rezagadaADN polimerasa IIIDos cadenas, dos estrategias

Paso 5 de 7

Dejar ARN dentro del ADN comprometería la molécula por dos vías. La ribosa es químicamente más inestable que la desoxirribosa. Y el uracilo, dentro del ADN, significa daño: la citosina se desamina espontáneamente y se convierte en uracilo, así que la célula patrulla el genoma con una enzima que escinde cualquier uracilo que encuentre, asumiendo que era una citosina averiada. La limpieza no es cosmética, es estructural.

Por qué importa

Es mucho más lenta que la polimerasa III —unos 20 nucleótidos por segundo— pero solo recorre los tramos cortos de los cebadores, no el genoma completo. Cada enzima está optimizada para su tarea.

El costo

La ADN polimerasa I tiene actividad exonucleasa 5' →3', que le permite degradar el cebador de ARN por delante mientras simultáneamente rellena el hueco con nucleótidos de ADN por detrás. A ese avance coordinado se le llama traslación de la muesca (nick translation) . Es la única polimerasa del proceso que degrada y sintetiza a la vez.

El mecanismo

Los cebadores son de ARN: llevan uracilo, no timina. La ADN polimerasa I los retira y rellena el hueco con ADN. ADN polimerasa IQuitando el ARNP

Aso 6 de 7

La ADN ligasa T4 es una herramienta fundamental de la clonación molecular: es la enzima que une el inserto con el vector en la construcción de ADN recombinante. El mismo mecanismo que cierra fragmentos de Okazaki permite construir plásmidos en el laboratorio.

Por qué importa

La ligasa de E. coli usa NAD ⁺ como fuente de energía, no ATP. Es una diferencia notable: la ligasa de eucariotas y la del fago T4 —la que se usa en biología molecular— sí dependen de ATP.

El costo

Tras el relleno de la polimerasa I queda una muesca (nick): los nucleótidos están completos y correctamente apareados, pero falta el enlace covalente entre el fosfato 5' de uno y el hidroxilo 3' del siguiente. La ligasa cataliza esa unión y convierte dos fragmentos contiguos en una sola cadena continua.

El mecanismo

Los nucleótidos ya están en su lugar, pero el esqueleto sigue roto. La ligasa forma el enlace fosfodiéster que cierra la muesca. ADN ligasaSellando la cadena

Paso 7 de 7

Es lo que garantiza que la información genética se transmita sin degradarse generación tras generación: cada copia se construye sobre un molde original, no sobre una copia de una copia.

Por qué importa

Meselson y Stahl lo resolvieron en 1958 cultivando E. coli en nitrógeno pesado (¹⁵N) y pasándola después a nitrógeno normal (¹⁴N). Tras una generación, todo el ADN tenía densidad intermedia, lo que descartaba el modelo conservativo. Tras dos generaciones aparecieron dos bandas, una intermedia y una ligera, lo que descartaba el dispersivo. Solo el semiconservativo predecía ese resultado exacto.

Cómo se demostró

Cada molécula hija conserva intacta una de las dos hebras de la molécula original y estrena la complementaria. Por eso el modelo se llama semiconservativo: se conserva la mitad. Las alternativas que se barajaban entonces eran el modelo conservativo —la molécula original queda intacta y se crea una copia enteramente nueva— y el dispersivo, con fragmentos viejos y nuevos entremezclados en ambas hebras.

El mecanismo

Cada una con una hebra vieja y una nueva . A eso se le llama replicación semiconservativa . Dos moléculas IDÉNTICASE

L resultado

El proceso completo, animado y explicado a fondo, en el video del Dogma Central. Y esto estáocurriendoahora mismo - Nelson, D. L. y Cox, M. M. (2021). Lehninger principles of biochemistry (8.ª ed.). Macmillan Learning. - Alberts, B., Heald, R., Johnson, A., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. (2022). Molecular biology of the cell (7.ª ed.). W. W. Norton & Company. - Meselson, M. y Stahl, F. W. (1958). The replication of DNA in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 44(7), 671–682. https://doi.org/10.1073/pnas.44.7.671 - Kunkel, T. A. (2004). DNA replication fidelity. Journal of Biological Chemistry, 279(17), 16895–16898. https://doi.org/10.1074/jbc. R400006200 - O'Donnell, M., Langston, L. y Stillman, B. (2013). Principles and concepts of DNA replication in bacteria, archaea, and eukarya. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 5(7), a010108. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a010108

Referencias

El minijuego interactivo del dogma central está en aequorea.net, junto con el resto de recursos descargables de la serie. El video completo desarrolla cada uno de estos pasos con animación en 3D.

Para seguir estudiando

Con dos moléculas idénticas de ADN, la célula ya puede dividirse. Pero tener la información copiada no sirve de nada si no se puede leer: ese es el trabajo de la transcripción, la carpeta 3 de esta serie.